产品中心

“抗逆基因的分离克隆与表达分析虚拟仿真实验”于2017年获批国家级虚拟仿真项目

一、实验目的

1.学习基因克隆技术的基本原理和操作流程;

2.学习掌握PCR技术的基本原理和操作过程;

3.学习基因克隆相关设备的结构原理和应用功能;

4.熟悉虚拟仿真教学系统的软件使用操作。

二、实验原理(或对应的知识点)

抗逆基因是编码一些抗逆性物质的基因，如编码抗干旱物质、抗高盐蛋白、抗毒蛋白等基因，抗性基因表达后的产物有助于生物在盐碱、干旱、低温、涝害等不利环境下生存。抗逆基因在基因工程中应用广泛。辽宁碱蓬S1ASR基因是一个抗旱基因，将该基因导入其他植物，如拟南芥，可使拟南芥的抗旱能力提高。PCR (聚合酶链式反应)是由美国科学家穆利斯提出的一种体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA快速扩增方法。此技术获得1993年诺贝尔化学奖。PCR是利用DNA在体外摄氏95°C高温时变性会变成单链，低温(60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA 聚合酶最适反应温度(72℃左右), DNA聚合酶沿着5'-3'的方向合成互补链。基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度，复性温度，延伸温度之间很好地进行控制。参加PCR反应的物质主要有五种即:引物(DNA片段)、酶、dNTP、模板和缓冲液(Mg2+)。 PCR 的最大特点，是在短时间内能将微量的DNA大幅增加。

操作步骤示例

基因克隆表达的基本步骤为:

第一步:目的基因的获取

1.目的基因是指: 编码蛋白质的结构基因。

2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法和化学合成法。

3.PCR技术扩增目的基因

(1)原理: DNA双链复制

(2)循环反应过程:变性--退火--延伸

第二步:基因表达载体的构建

1.目的:使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。

2.组成:目的基因+启动子+终止子+标记基因

(1)启动子:是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。

(2)终止子:也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。

(3)标记基因的作用:是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。常用的标记基因是抗生素基因。

第三步:将目的基因导入受体细胞

1.转化的概念:目的基因进入文体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。

2.常用的转化方法:

将目的基因导入植物细胞:采用最多的方法是农杆菌转化法，其次还有基因枪法和花粉管通道法等。

将目的基因导入动物细胞:主要为显微注射技术，此方法的受体细胞多是受精卵。

将目的基因导入微生物细胞:原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，最常用的原核细胞是大肠杆菌，其转化方法是:先用Ca*处理细胞，使其成为感受态细胞，再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合，在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子，完成转化过程。

3.重组细胞导入受体细胞后，筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标记基因是否表达。

第四步:目的基因的检测和表达

1.检测转基因生物的染色体DNA.上是否插入了目的基因，采用DNA分子杂交技术检测。

2.检测目的基因是否转录出了mRNA， 检测方法为用标记的目的基因作探针与mRNA 杂交。

3.检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原-抗体杂交。

4.某些情况下还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗旱植物是否出现抗旱性状。

虚拟仿真PCR原理及操作                                                                    操作步骤示例: Inner PCR 反应体系